本文原载于《中华临床感染病杂志》年第6期
近年来，随着抗生素的广泛应用、侵入性诊疗技术的开展和免疫抑制剂的应用，医院的重要感染性疾病，如不进行及时有效的治疗，严重威胁患者生命。在一些研究中，肺炎克雷伯菌已成为血流感染的第二大细菌[1]，该菌还可引起肺炎、泌尿系统和手术部位感染等。研究认为，肺炎克雷伯菌血流感染患者尤其是碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)血流感染患者治疗失败率较高，且医疗费用昂贵[2,3]。CRKP血流感染患者病死率高达27.8%～66.7%[4,5]，已严重危胁公众健康[6]。入住重症监护病房(ICU)、住院时间延长、抗生素联合使用、器官功能较差、器官移植、多部位侵入性操作和接触CRKP携带者是CRKP血流感染的高危因素[7,8]。本研究主要对我院肺炎克雷伯菌血流感染的临床特征和耐药性进行分析，并探讨其碳青霉烯耐药机制。
1 材料与方法
1.1 菌株收集
收医院年3月至9月分离于血流感染患者的肺炎克雷伯菌。对于同一患者多次血培养分离出的肺炎克雷伯菌，只收集首次分离培养的菌株。收集患者的临床资料，包括性别、年龄、科室、侵入性操作(如手术情况、留置导管、机械通气)、免疫抑制剂使用和临床结局等。
1.2 菌种鉴定和分组
利用MALDI-TOF进行菌种鉴定。具体操作如下：利用消毒牙签挑取少量单克隆菌落均匀涂布在质谱点样板上，加1μL质谱基质液，在室温自然晾干，打开质谱靶板舱门，放入点样靶板，进行菌种鉴定。菌种鉴定评分值≥2时，认为鉴定结果准确可信[9]。将患者分为碳青霉烯耐药(CRKP)组和碳青霉烯敏感(CSKP)组，其中碳青霉烯耐药菌株为对厄他培南、亚胺培南和美罗培南中的任一种抗生素耐药[10]。
1.3 药敏试验测定
抗菌药物包括：头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美洛培南、替加环素、庆大霉素、复方磺胺甲恶唑、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星和呋喃妥因。药敏试验结果解释参考美国临床实验室标准化协会推荐折点CLSI[10]。
1.4 PCR扩增CRKP耐药基因
适量刮取M-H琼脂平板上新鲜培养的菌落，放入含有μL双蒸水的EP管中，反复吹打均匀，沸水浴10min，4℃，10×g离心2min，吸取上清液至干净的EP管中即为粗制的PCR反应模板。blaKPC、blaNDM-1、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48-like50μL反应体系：10×PCR缓冲液，3.5mmol/L镁离子，2mmol/LdNTPs，μmol/L引物，0.25UTaq酶，1μL粗制模板。95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火复性30s，72℃延伸40s；第二步至第四步进行30个循环。72℃延伸10min。PCR产物取3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。
1.5 主要试剂与仪器
采用梅里埃公司GN16药敏测定卡进行药敏试验，采用全自动VitekCompactII进行测定。实验过程中的引物由上海生工生物科技公司合成。实验过程所用的PCR相关试剂、0bpDNAMarker购于大连TAKARA公司。PCR扩增仪(Bio-RadC0)、电泳仪及凝胶成像系统医院检验科PCR基因实验室提供。测序为杭州博尚生物科技公司提供。
1.6 统计学方法
采用SAS6.12统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。P0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 菌株收集分析
血培养分离出肺炎克雷伯菌49株，其中来自消化科胰胆管造影术(ERCP)诊疗患者12株(24.5%)，ICU患者11株(22.4%)，急诊科发热待查患者10株(22.4%)，血液科化疗后粒缺患者7株(14.3%)，以及其他科室患者9株(18.4%)。
2.2 药敏试验和耐药基因检测
49株肺炎克雷伯菌中，CSKP组26株，CRKP组23株。CSKP组菌株对三代头孢菌素、β-内酰胺/抑制剂复合制剂、氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素均具有较高的敏感性，而CRKP组菌株除对亚胺培南完全耐药外，对其他种类的抗菌药物也具有较高的耐药率。两组菌株的药敏试验结果见表1。23株CRKP菌株中，除1株未检测到碳青霉烯酶耐药基因外，其他菌株均携带耐药基因blaKPC-2，均未检出blaNDM-1、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48-like。
2.3 CRKP组与CSKP组临床特征比较
两组患者的科室分布差异具有统计学意义(χ2＝17.67，P0.01)。CRKP患者中，ICU患者所占比例最多，为43.5%。有创操作在两组患者中的分布差异亦有统计学意义(P0.01或0.05)。CRKP组病死率/放弃治疗率高于CSKP组(χ2＝16.89，P0.01)。
3 讨论
血流感染是一种严重的全身感染性疾病，常见的病原菌谱包括：凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌等[11]。近年来，多重耐药菌引起的血流感染日益增多，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)、CRKP、多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)等。一方面，多重耐药菌引起的血流感染常常无药可用或所选治疗药物受限[12]；另一方面，多重耐药菌的流行播散将导致医疗成本极速增长[2,3]。因此，多重耐药菌引起的血流感染越来越受到临床的中医白癜风医院白癜风的症状和治疗
